ECL 化学发光试剂盒

T1-SP100/T1-SP500

产品概述：

ECL是一款应用于Western blotting检测的超灵敏、低背景的化学发光辣根过氧化物酶底物。样品制备，转膜及抗体孵育等信号检测前环节操作与常规Western blotting步骤一致。公司提供3种剂型：常规剂型ECL（A液和B液）以及检测灵敏度更高的增强型ECL和超敏型ECL。

一、使用步骤：

1.常规 Western blotting 蛋白样品制备定量、电泳、转膜。

2.将蛋白样品转移至PVDF 或NC 膜上，室温封闭1小时。

3.室温下，一抗孵育转印膜1小时，摇床轻摇使抗体孵育均匀。

4.洗膜3次，每次5分钟。

5.室温下，二抗孵育转印膜1小时，摇床轻摇使抗体孵育均匀。

6.洗膜3次，每次5分钟。

7.将ECL试剂盒中的A液和 B液以（1︰1）等体积混匀，将混匀后的ECL检测工作液充分浸润完成抗体孵育的蛋白转印膜（约0.1mL/cm2），反应2分钟，吸出反应液，用保鲜膜覆盖湿润的转印膜，暗室内曝光压片或者使用CCD成像。

二、Western blotting 发光检测中的常见问题：

现象	原因	解决办法
信号弱或无信号	ECL 发光底物检测灵敏度偏低	更换灵敏度更高的 ECL 发光底物
	抗体-抗原结合亲和度偏低	提高抗体浓度/蛋白样品上样量
	转膜不充分/过剩	优化转膜条件
	HRP 或底物活性降低	检查、测试底物活性或选择更高灵敏度发光底物
高背景	HRP 偏高(背景较高)	一抗稀释 10 倍/二抗稀释 5 倍
	封闭时间不足	延长封闭时间，室温 4 ℃过夜为佳
	抗体与封闭液产生交叉反应	更换封闭液(如含 3 % BSA 的 TBST)
	TBST 洗脱不充分	增加洗脱时间、次数、洗脱液用量
	曝光时间过长	缩短曝光时间
	抗原-抗体复合物浓度偏高	降低抗体浓度或蛋白样品上样量
条带内无显影的白点	转膜失误（如在胶-膜之间产生气泡)	精细操作
	膜平衡不均/油脂污染	按照说明书平衡转印膜/佩戴手套，以洁净平头镊子持膜
	膜与 X 光片间有气泡	显影前驱赶消除气泡
非特异性条带	抗体交叉反应	提高一抗/二抗稀释比
散在小圆斑	封闭液中有杂质颗粒	静置牛奶，使大颗粒沉淀，取上层溶液使用
反影(白色条带， 黑色背景)	HRP 过高(背景较深)	提高一抗/二抗稀释比
显影后，印迹膜上条 带处泛黄	HRP 过高(灵敏度过高)	提高一抗/二抗稀释比

三、注意事项：

1. ECL 发光底物，除增强型 ECL（4℃储存）外，其他款式建议室温储存，常规型ECL 及超敏型 ECL 发光底物中含特殊稳定剂，更适合室温存储，长期 4℃存放，反而易降低该检测试剂的灵敏度。

2. 增强型 ECL 发光底物的信号检测灵敏度已高于目前市面上其他一般国产超敏 ECL 发  光底物，当待测蛋白样品表达丰度较高时，可能会出现高背景现象，此时建议在原有抗体 稀释比参数基础上，将一抗稀释 10倍，二抗稀释 5倍，若仍出现高背景结果，则需继续提高抗体稀释倍数为宜。

四、印迹膜面积与发光底物工作液用量参考表： 

印迹膜大小	所需发光底物工作液用量
7.0 ×8.5 cm	6 mL (3 mLA 液 + 3 mL B 液)
10 × 10 cm	10 mL (5 mLA 液 + 5 mL B 液)
8.5 ×13.5 cm	12 mL (6 mLA 液 + 6 mL B 液)