中性粒细胞胞外诱捕网检测试剂盒

产品简介：

1.本试剂盒提供了可用于NETs检测的试剂盒，通过体外刺激诱导产生NETs，对其进行定性和定量检测；

2.本试剂盒适用于不同物种NETs的检测，包括人、狗、猪、羊、鼠等；

3.本试剂盒既适用于血液样本，也适用于细胞样本NETs检测；

4.本试剂盒适用于检测生理或病理条件下受试者NETs的生成能力，对促进或抑制NETs生成药物的筛选，以及其他与NETs相关的免疫实验研究等。

5.本试剂盒可以测定50个样本。

包装清单：

保存条件：

溶液P2于-80℃冰箱中保存1年，避免反复冻融。

溶液P1、P3、P4、P5于-20℃保存1年，避免反复冻融。

溶液P6于4℃保存1年。

注意事项：

1.使用前将试剂分装保存，避免反复冻融；

2.实验操作结束请尽快进行流式检测，避免荧光损失；

3.为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套进行操作。

使用说明：

1.分离、纯化中性粒细胞：

2.预处理细胞，消除外源NETs：

1）向上述细胞中缓慢滴入100ul前处理液（P1），同时缓慢转动离心管，并重悬细胞；

2）室温下孵育15分钟；

3）向离心管中加入25ml的含有10%FBS的RPIM培养基悬浮细胞，300 x g ，离心10 分钟，小心去除全部上清；

4）台盼蓝染色，计数板计数。

5）用含有5%FBS的RPMI培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1 x 106/ml。

3.刺激中性粒细胞活化，诱导NETs生成

1）取200ul上述悬浮细胞置于四孔小室细胞培养玻片的一个孔中，设置对照组与实验组，留做后续第三步免疫荧光染色做NETs生成的定性分析。

2）取200ul上述悬浮细胞置于96孔板中，设置对照组与实验组，留做后续第四步NETs生成的定量分析。

3）向实验组中加入5ul 刺激液（P2）于上述细胞中，对照组中加入5ul PBS；

4）37℃孵育3小时。

4.NETs生成的定性分析

1）直接向上述八孔小室载玻片中的中性粒细胞加入4%多聚甲醛（PFA），至终浓度为1%。4℃固定过夜。

2）吸去上清，每孔加入200ul PBS洗涤，去除PBS。

3）每孔加入100ul 封闭液（如含有5%BSA和5%山羊血清的PBS），室温封闭1小时。

4）利用含有1%BSA的PBS，按照1:100的比例稀释抗DNA/组蛋白H1抗体（P3）。向每孔细胞中加入100ul稀释好的抗体，室温孵育1小时。

5）吸去抗体，PBS洗两次，每次5分钟；吸去PBS。

6）利用含有1%BSA的PBS，按照1:100稀释荧光二抗（P4）。向每孔细胞加入100ul稀释好的抗体，室温避光孵育1小时。

7）吸去抗体，PBS洗两次，每次5分钟；吸去PBS。

8）用PBS按照1:100的比例稀释DAPI溶液（P5），向每孔细胞加入100ul稀释液，室温避光孵育5分钟。

9）移去DAPI溶液，用镊子取出小室。PBS洗两次。

10）加一滴抗荧光淬灭封片液于细胞上，盖上盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。

11）荧光显微镜下观察NETs的形成情况。

5.NETs生成的定量分析

1）向第二步中加入1%BSA的PBS，按照1:100的比例稀释DNA染料（P6）。

2）室温避光孵育5分钟。

3）吸出细胞及上清至流式管中，1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入200ul PBS。

4）利用流式细胞术（488 nm激发滤光片和530/30发射滤光片）检测荧光强度。